1. PCR quantitativa in tempo reale
Nel 1996, la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR in tempo reale) è stata introdotta per la prima volta da Applied Biosystems negli Stati Uniti. Il cosiddetto qPCR in tempo reale si riferisce all'aggiunta di gruppi fluorescenti alla reazione PCR per monitorare continuamente il segnale fluorescente. L'ordine di apparizione e il cambiamento della potenza del segnale possono essere utilizzati per analizzare la quantità iniziale del gene bersaglio in tempo reale. L'invenzione di questa tecnologia realizza il salto dalla PCR qualitativa a quella quantitativa.
2. Prodotti chimici utilizzati nella fluorescenza PCR
Allo stato attuale, il qPCR in tempo reale è diviso in due categorie: coloranti fluorescenti e sonde fluorescenti in base alle diverse sostanze chimiche fluorescenti utilizzate.
3. Coloranti utilizzati nella fluorescenza PCR
I coloranti fluorescenti sono anche chiamati coloranti leganti del DNA. La principale molecola di colorante attualmente utilizzata è SYBR Green I. SYBR Green I può legarsi specificamente al solco minore del DNA a doppio filamento. Free SYBR Green I non ha quasi alcun segnale fluorescente, ma si lega al DNA a doppio filamento. Dopo di ciò, il suo segnale di fluorescenza può essere aumentato di centinaia di volte. Con l'aumento del prodotto PCR, aumenta anche la quantità di legame del prodotto PCR e del colorante e l'intensità del segnale di fluorescenza rappresenta il numero di molecole di DNA a doppio filamento.
I vantaggi dei coloranti fluorescenti sono che sono facili da usare, possono essere combinati con qualsiasi prodotto PCR e sono economici.
In generale, il metodo SYBR Green I è uno degli esperimenti qPCR in tempo reale più basilari e comunemente usati.
4. Sonde per fluorescenza PCR
Le sonde fluorescenti più comunemente utilizzate in qPCR in tempo reale sono le sonde TaqMan. Il principio di base è progettare e sintetizzare una sonda che possa ibridarsi specificamente al gene bersaglio. L'estremità 5 'della sonda è etichettata con un fluoroforo e l'estremità 3 'è etichettata con un gruppo quencher.
In circostanze normali, la distanza spaziale tra i due gruppi è molto vicina e il gene fluorescente non può produrre fluorescenza a causa della tempra. Durante l'amplificazione PCR, il primer e la sonda si legano contemporaneamente al modello e la posizione di legame della sonda si trova tra i primer a monte e a valle.
Quando l'amplificazione si estende nella posizione in cui la sonda si lega, l'enzima Taq utilizza l'attività di esonucleasi 5 'per scindere la molecola fluorescente attaccata all'estremità 5 'della sonda dalla sonda, provocandone la fluorescenza. Il numero di molecole fluorescenti rilevate è proporzionale al numero di prodotti PCR, pertanto il numero di modelli di DNA iniziali può essere calcolato in base all'intensità di fluorescenza nel sistema di reazione PCR.
La tecnologia della sonda TaqMan risolve il problema della combinazione di coloranti fluorescenti e amplificazione non specifica. Dopo la reazione, non è necessario il rilevamento della curva di fusione, che accorcia il tempo di prova.
I vantaggi della tecnologia della sonda TaqMan sono il fondo a bassa fluorescenza, l'elevata sensibilità, l'elevata stabilità dell'ibridazione, la buona risoluzione spettrale della fluorescenza e l'elevata specificità.
A causa dell'elevata specificità delle sonde TaqMan, può essere utilizzato per la discriminazione allelica, in particolare per i polimorfismi genici umani e per distinguere e quantificare i ceppi basati su SNP.
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