Barcazioni. Il principio della tecnologia PCR
Quest'anno, la COVID-19 infuria in tutto il mondo e tutti devono aver sentito parlare dei test degli acidi nucleici. Nel rilevamento dell'acido nucleico dell'epidemia, la tecnologia della fluorescenza PCR svolge un ruolo centrale, che può aiutare gli ispettori a determinare in modo rapido e preciso se sono infetti dal COVID-19.
Quindi cos'è esattamente la tecnologia PCR?
PCR è un acronimo per Polimerasi Chain Reaction. In breve, la PCR consiste in tre fasi di reazione di base: denaturazione ad alta temperatura-ricottura a bassa temperatura-estensione a media temperatura:
1. Denaturazione del DNA per diventare a filamento singolo
Dopo che il DNA del modello viene riscaldato a circa 95 ° C per un certo periodo di tempo, il doppio filamento del DNA modello viene dissociato in un singolo filamento in modo che possa legarsi al primer e prepararsi per il successivo ciclo di reazione.
2. ricottura a bassa temperatura
Dopo che il DNA modello è stato denaturato in singoli filamenti, la temperatura viene abbassata a circa 55 ° C e i primer sono accoppiati con le sequenze complementari dei singoli filamenti di DNA modello.
3. Estensione di temperatura media
Sotto l'azione dell'enzima Taq, il modello di DNA e i coniugati di primer utilizzano dNTP come materia prima di reazione e la sequenza target come modello, secondo il principio dell'accoppiamento di basi e della replicazione semi-riservata, e infine sintetizzare una nuova catena di replicazione semi-riservata complementare alla catena del DNA modello..
Tor. Metodi di rilevazione della PCR fluorescente
Allo stato attuale, la maggior parte dei reagenti di rilevamento COVID-19 approvati dalla State Drug Administration of China utilizzano metodi PCR fluorescenti per rilevare il COVID-19.
Il metodo PCR fluorescente si riferisce all'aggiunta di gruppi fluorescenti al sistema di reazione PCR. Con il progresso dell'amplificazione PCR, i prodotti di reazione continuano ad accumularsi e anche l'intensità del segnale di fluorescenza aumenta proporzionalmente. Grafico della curva di amplificazione della fluorescenza, rilevamento in tempo reale del processo di fluorescenza PCR.
Ⅲ. Principi di selezione dei materiali di consumo fluorescenti PCR
1. Materiale
La PCR è generalmente realizzata in materiale PP, poiché i materiali di consumo PCR/qPCR sono solitamente in contatto diretto con reagenti o campioni, mentre il materiale polipropilene (PP) è un materiale biologicamente inerte, la superficie non è facile da aderire alle biomolecole e ha una buona resistenza chimica e temperatura. Tolleranza (può essere autoclavato a 121 ° C e può anche resistere alle variazioni di temperatura durante il ciclo termico). I materiali di consumo PCR sono tutti materiali PP.
2. volume del tubo/piastra PCR
Come scegliere tubi/piastre PCR di diversi volumi?
Scopo della selezione: selezionare il prodotto appropriato in base ai requisiti sperimentali specifici. Il volume dei tubi PCR può soddisfare principalmente i requisiti delle reazioni PCR. I tubi PCR sono ideali per esperimenti PCR/qPCR a bassa e media produttività, con singoli tubi e strisce che sono i due formati più comunemente usati.
Un singolo tubo fornisce la flessibilità per impostare il numero esatto di reazioni da eseguire. In alternativa, è possibile selezionare un singolo tubo da 0,5 ml per volumi di reazione più grandi.
Gli accoppiamenti sono generalmente disponibili in formato 8 o 12 tubi con tappi separati o con tappi. Compatibile con pipette monocanale e multicanale per esperimenti a bassa e media produttività. Le strisce con i cappucci aprono e chiudono i tubi del campione in modo indipendente per prevenire la contaminazione del campione.
3. Spessore della parete
Lo spessore della parete del tubo influisce direttamente sulla conduttività termica e gli spessori delle pareti estremamente sottili ottimizzano il trasferimento di calore e riducono il tempo di ciclo. La plastica a parete ultrasottile è più sottile di circa il 50% rispetto alla versione standard, riducendo ulteriormente la barriera termica, determinando una risposta più rapida e robusta. I materiali di consumo PCR sono tutte pareti ultrasottili del tubo.
4. Colore
Le piastre PCR sono spesso disponibili in una varietà di diversi formati di colore per facilitare la differenziazione visiva e l'identificazione dei campioni, specialmente negli esperimenti ad alto rendimento. Per le normali reazioni PCR, è possibile utilizzare tubi PCR trasparenti o colorati e tubi PCR trasparenti sono più utili per la gestione della classificazione dei campioni.
Sebbene il colore della plastica non abbia alcun effetto sull'amplificazione del DNA, i materiali di consumo PCR bianchi di alta qualità sono raccomandati per qPCR. Poiché qPCR richiede il rilevamento quantitativo in tempo reale dell'intensità del segnale di fluorescenza, è necessaria una trasmissione del segnale di fluorescenza sensibile e accurata. Gli esperimenti hanno dimostrato che, rispetto ai tradizionali prodotti PCR trasparenti, i prodotti PCR bianchi possono riflettere il segnale fluorescente nella massima misura, ridurre la contaminazione incrociata dei segnali spaziali, e ottenere i risultati della PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale.
Diverse marche di strumenti, a causa del diverso design della posizione del rilevatore di fluorescenza, si prega di fare riferimento ai materiali raccomandati dal produttore. Per lo strumento PCR in tempo reale Bio-Rad CFX o Roche 480, il produttore consiglia di utilizzare piastre PCR bianche. Poiché la piastra PCR è bianca o trasparente e ha varie specifiche, è adatta per strumenti PCR comuni sul mercato.
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